Медицинский портал. студентам, врачам, медицинские книги

скачать медицинские учебники, лекции

Главная » Файлы » Иммунология

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ
20.04.2010, 00:17


Основные методы оценки Т- и В-систем иммунитета связаны с определением количества и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. В связи с этим важной процедурой подготовительного этапа является выделение чистой суспензии лимфоцитов периферической крови.
К числу наиболее употребительных относится метод выделения клеток на градиенте плотности фиколлпака. Смешивая фиколл и пак в определенной пропорции, получают раствор, имеющий плотность 1.077 г/см. Центрифугируя периферическую кровь после наслаивания на градиент, удается разделить клетки, имеющие плотность ниже (лимфоциты, моноциты) и выше (эритроциты. гранулоциты), чем 1.077 г/см.

Материалы и оборудование

1. Фиколл-400 - полисахарид.
2. Пак - рентгеноконтрастное вещество (аналоги: верографин, изопак, уро-
графин, уротраст, урополониум, уромиро, низотраст-370, триозил, ронпакон,
омнипак и др.).
3. Среда 199.
4. Стерильная дистиллированная вода.
5. 3% раствор уксусной кислоты.
6. Центрифуга с бакет-ротором.
7. Ареометр с пределами измерений от 1.060 г/см до 1.090 г/см.
8. Камера Горяева.
9. Микроскоп.
10. Лабораторная посуда, конические центрифужные пробирки,весы для
уравновешивания центрифужных пробирок и др.

Описание метода

1. Приготовление фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколла-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.
2. Приготовление раствора рентгеноконтрастного вещества (например, урот-раста): 10.14 (20.28) мл 75% раствора уротраста доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.
3. Приготовление градиента плотности: растворы фиколла и уротраста смешивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколла, если ниже - раствор уротраста. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4 в склянке из оранжевого стекла. При отсутствии фиколла градиент плотности можно приготовить только из одного рентгеноконтрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора уротраста смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл 0.1% раствора хлористого натрия. Полученный при этом 14.3% раствор уротраста имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.
4. Выделение лимфоцитов: периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл берут в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25 ед в 1 мл крови. Кровь должна отстояться в течение 40-60 мин при комнатной температуре до четкого разделения эритроцитов и плазмы.
4а. В центрифужную пробирку наливают 2-3 мл градиента плотности, на него наслаивают 4-6 мл отстоявшейся плазмы и верхний слой эритроцитов. Соотношение объемов градиент: плазму выдерживают в пределах 1:2 - 1:4.
4б. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°С. В процессе центрифугирования эритроциты и гранулоциты "проваливаются" в градиент и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее в основном из лимфоцитов с примесью моноцитов. Над слоем лимфоцитов находится плазма. Плазму собирают в отдельную пробирку для последующего анализа на иммуноглобулины; лимфоциты отсасывают в сухую коническую центрифужную пробирку.
4в. К суспензии лимфоцитов добавляют 3-4 мл среды 199 и содержимое пробирки тщательно перемешивают. После этого пробирки центрифугируют с ускорением 200-300 g при температуре 20°С, затем надосадочную жидкость удаляют, а процедуру отмывки повторяют еще один раз.
4г. После отмывания готовят рабочую концентрацию лимфоцитов, содержащую 2x10 клеток в 1 мл. Перед приготовлением рабочей концентрации сосчитывают исходное количество лимфоцитов:
- к 0,1 мл осадка отмытых клеток добавляют 0,9 мл среды 199, суспензию тщательно перемешивают;
- в чистую пробирку вносят 0,38 мл 3% раствора уксусной кислоты и 0,02 мл взвеси лимфоцитов;
- в камере Горяева подсчитывают лимфоциты в 100 больших квадратах и полученное число умножают на 50000. Результат соответствует количеству лимфоцитов в 1 мл суспензии. Для приготовления рабочей концентрации лимфоцитов полученное число делят на 2x10, из результата вычитают 1, остаток представляет собой количество питательной среды 199 в мл, которое необходимо добавить в пробирку с лимфоцитами.
Приготовленную по данной методике суспензию лимфоцитов можно хранить при температуре + 4° С в течение 2 часов.



Похожие статьи Добавь в закладки

Категория: Иммунология | Добавил: MedVUZ | Теги: лимфоциты, иммунолгия, иследование
Просмотров: 5720 | Загрузок: 0 | Рейтинг: 1.0/1
Всего комментариев: 0
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи.
[ Регистрация | Вход ]

РязГМУ поступить контакты сайт история медицинская академия информация скачать акушерство ОЗЗ Доктор Хаус Scrubs сериалы хирургия телефон лекции стоматология офтальмология Хью Лори клиника экзамен Теория Лжи юмор интерны актёры Доктор Тырса терапия PDF практические навыки фармакология учебник диагностика классификация лечение ЕГЭ травматология