Основные методы оценки Т- и В-систем иммунитета связаны с определением количества и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. В связи с этим важной процедурой подготовительного этапа является выделение чистой суспензии лимфоцитов периферической крови.
К числу наиболее употребительных относится метод выделения клеток на градиенте плотности фиколлпака. Смешивая фиколл и пак в определенной пропорции, получают раствор, имеющий плотность 1.077 г/см. Центрифугируя периферическую кровь после наслаивания на градиент, удается разделить клетки, имеющие плотность ниже (лимфоциты, моноциты) и выше (эритроциты. гранулоциты), чем 1.077 г/см.

1. Фиколл-400 - полисахарид.
2. Пак - рентгеноконтрастное вещество (аналоги: верографин, изопак, уро-
графин, уротраст, урополониум, уромиро, низотраст-370, триозил, ронпакон,
омнипак и др.).
3. Среда 199.
4. Стерильная дистиллированная вода.
5. 3% раствор уксусной кислоты.
6. Центрифуга с бакет-ротором.
7. Ареометр с пределами измерений от 1.060 г/см до 1.090 г/см.
8. Камера Горяева.
9. Микроскоп.
10. Лабораторная посуда, конические центрифужные пробирки,весы для
уравновешивания центрифужных пробирок и др.

1. Приготовление фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколла-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.
2. Приготовление раствора рентгеноконтрастного вещества (например, урот-раста): 10.14 (20.28) мл 75% раствора уротраста доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.
3. Приготовление градиента плотности: растворы фиколла и уротраста смешивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколла, если ниже - раствор уротраста. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4 в склянке из оранжевого стекла. При отсутствии фиколла градиент плотности можно приготовить только из одного рентгеноконтрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора уротраста смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл 0.1% раствора хлористого натрия. Полученный при этом 14.3% раствор уротраста имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.
4. Выделение лимфоцитов: периферическую кровь из локтевой вены в объеме 10 мл берут в пробирку, содержащую гепарин, в конечной концентрации 25 ед в 1 мл крови. Кровь должна отстояться в течение 40-60 мин при комнатной температуре до четкого разделения эритроцитов и плазмы.
4а. В центрифужную пробирку наливают 2-3 мл градиента плотности, на него наслаивают 4-6 мл отстоявшейся плазмы и верхний слой эритроцитов. Соотношение объемов градиент: плазму выдерживают в пределах 1:2 - 1:4.
4б. Пробирки центрифугируют в течение 40 мин в бакет-роторе с ускорением 200 g (1500-1800 об/мин) при температуре 20°С. В процессе центрифугирования эритроциты и гранулоциты "проваливаются" в градиент и оседают на дно пробирки. На верхней границе градиента при правильном разделении образуется рыхлое кольцо беловатого цвета, состоящее в основном из лимфоцитов с примесью моноцитов. Над слоем лимфоцитов находится плазма. Плазму собирают в отдельную пробирку для последующего анализа на иммуноглобулины; лимфоциты отсасывают в сухую коническую центрифужную пробирку.
4в. К суспензии лимфоцитов добавляют 3-4 мл среды 199 и содержимое пробирки тщательно перемешивают. После этого пробирки центрифугируют с ускорением 200-300 g при температуре 20°С, затем надосадочную жидкость удаляют, а процедуру отмывки повторяют еще один раз.
4г. После отмывания готовят рабочую концентрацию лимфоцитов, содержащую 2x10 клеток в 1 мл. Перед приготовлением рабочей концентрации сосчитывают исходное количество лимфоцитов:
- к 0,1 мл осадка отмытых клеток добавляют 0,9 мл среды 199, суспензию тщательно перемешивают;
- в чистую пробирку вносят 0,38 мл 3% раствора уксусной кислоты и 0,02 мл взвеси лимфоцитов;
- в камере Горяева подсчитывают лимфоциты в 100 больших квадратах и полученное число умножают на 50000. Результат соответствует количеству лимфоцитов в 1 мл суспензии. Для приготовления рабочей концентрации лимфоцитов полученное число делят на 2x10, из результата вычитают 1, остаток представляет собой количество питательной среды 199 в мл, которое необходимо добавить в пробирку с лимфоцитами.
Приготовленную по данной методике суспензию лимфоцитов можно хранить при температуре + 4° С в течение 2 часов.