Медицинский портал. студентам, врачам, медицинские книги

скачать медицинские учебники, лекции

Главная » Файлы » Иммунология

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЕТОДОМ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ
21.04.2010, 00:45


Метод радиальной иммунодиффузии в геле агарозы является в настоящее время основным при определении содержания иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови.

Материалы и оборудование

1. Стекла 9x12 см.
2. П-образная рамка 120x90x8 мм для облегчения заливки стекла агаром.
3. Водяная баня на 50-60°С.
4. Пастеровские пипетки с оттянутым концом.
5. Влажная камера.
6. Измеритель.
7. Калибровочная линейка.
8. Коммерческие наборы для определения концентрации иммуноглобулинов
производства "СЕВАК", ЧССР.
9. 0,2 М вероналовый буфер.
10. Реактив для окраски преципитатов.
11. Пробойник круглый диаметром 1.5-2.0 мм для вырезания лунок в геле
агарозы.

Описание метода

Приготовление вероналового буфера: 1,84 г веронала и 0,34 г едкого натра растворяют в 200 мл дистиллированной воды.
Приготовление геля агарозы: агарозу из набора для определения иммуноглобулинов в сыворотке крови "СЕВАК" в количестве 3,6 г высыпают в 200 мл ве-роналового буфера, подогретого до температуры 50-60°С, после чего кипятят в течение 10-15 мин на водяной бане до полного расплавления агара и получения прозрачного геля. Расплавленный агар фильтруют через вату и разливают по 21 мл в подогретые стеклянные цилиндры, которые закрывают пробками и помещают на водяную баню с температурой 56-58°С. Ампулу моноспецифической сыворотки с рабочим титром 1:20-1:30 разводят в 1 мл вероналового буфера, выливают в соответствующий цилиндр, перемешивают и 10-15 мин выдерживают в водяной бане.
Стеклянные пластины размером 9x12 см протирают эфиром, на стекле помещают ограничительную рамку (при отсутствии рамки края можно обработать парафином). Подготовленные таким образом пластины подогревают и помещают на строго горизонтальную поверхность. На середину пластины из цилиндра быстро выливают расплавленный агар, содержащий моноспецифическую сыворотку. Гель с помощью стеклянной палочки быстро и равномерно распределяют по всей поверхности стекла, пузырьки воздуха тщательно удаляют. Пластину с гелем оставляют на горизонтальной поверхности до полного затвердения агара.
С помощью круглого штампа по трафарету в геле вырезают лунки. Расстояние от края стекла до лунок и между лунками должно быть не менее 10 мм. На одном стекле размером 9x12 см можно разместить до 48 лунок. Агар из лунок удаляют пастеровской пипеткой, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом. Подготовленные пластины при необходимости можно хранить во влажной камере при температуре 4°С.
Исследуемую сыворотку с помощью пастеровской пипетки с тонко оттянутым концом вносят в лунки до исчезновения вогнутого мениска. Каждую сыворотку вносят в лунки агаровых пластин, содержащих ту или иную моноспецифическую сыворотку. В 4 лунки агаровой пластины вносят цельную и разведенную в 2, 4, 8 раз стандартную (эталонную) сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов всех классов. Ампула со стандартной сывороткой входит в каждый набор моноспецифических сывороток. После внесения исследуемых сывороток пластины помещают во влажную камеру, в качестве которой можно использовать эксикатор с налитой на дно водой или другую подходящую посуду с крышкой и инкубируют в течение 24 часов (для определения IgA и IgG) или 48 часов (для определения IgM и IgD).
После инкубации пластины извлекают из влажной камеры и окрашивают подходящим красителем: бромфеноловым синим (состав краски: бромфеноло-вый синий 0.5 г, свинец уксуснокислый 4% водной раствор - 10 мл, уксусная кислота ледяная 20 мл, вода дистиллированная до 1 л), амидо черным 10 В (состав краски: 1% амидо черного в 7% водном растворе уксусной кислоты).

Учет результатов

Для оценки результатов реакции измеряют диаметр образовавшихся вокруг лунок колец преципитации. Затем на полулогарифмической бумаге наносят на оси абсцисс диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат - известную концентрацию каждого класса иммуноглобулинов в г/л и строят калибровочный график, с помощью которого вычисляют содержание иммуноглобулинов в каждой исследуемой сыворотке.
В норме в сыворотке содержится 0,65-1,65 г/л IgM; 7,50-15,45 г/л IgG; 1,252,5 г/л IgA.



Похожие статьи Добавь в закладки

Категория: Иммунология | Добавил: MedVUZ | Теги: иследования, иммунолгия, лабораторная диагностика, иммуноглобулины, количесвенное определение
Просмотров: 4978 | Загрузок: 0 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи.
[ Регистрация | Вход ]

РязГМУ поступить контакты сайт история медицинская академия информация скачать акушерство ОЗЗ Доктор Хаус Scrubs сериалы хирургия телефон лекции стоматология офтальмология Хью Лори клиника экзамен Теория Лжи юмор интерны актёры Доктор Тырса терапия PDF практические навыки фармакология учебник диагностика классификация лечение ЕГЭ травматология