Медицинский портал. студентам, врачам, медицинские книги

скачать медицинские учебники, лекции

Главная » Файлы » Иммунология

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫХ антигенов т-лимфоцитов
20.04.2010, 19:55


Установлено, что на клеточной поверхности Т-лимфоцитов имеются специфические антигенные детерминанты (дифференцировочные антигены), позволяющие выявлять субпопуляции этих клеток. В настоящее время одним из наиболее точных методов определения Т-лимфоцитов и их субпопуляций является непрямая иммунофлюоресцентная реакция с моноклональными антителами, полученными к дифференцировочным антигенам, локализованным на поверхности лимфоцитов. Широкое диагностическое применение получили мышиные моноклональные антитела ОКТ. СБ3+ выявляют более 95% периферических Т-лимфоцитов, CD4+ - 55-65% периферических Т-хелперов/Т-амплификаторов, CD8+ -34-35% периферических Т-супрессоров/цитотоксических Т-лимфоцитов. Имеются также и другие моноклональные антитела (ОКТ5, ОКТ6, ОКТ 11 и т.д.). Применение данных реагентов основано на способности моноклональных антител фиксироваться на поверхности жизнеспособных клеток, выявляя специфические антигенные детерминанты после дополнительной обработки лимфоцитов антимышиными иммуноглобулинами, меченными флюоресцеинизотиоцианатом
(ФИТЦ).

Материалы и оборудование

1. Исследуемая суспензия лимфоцитов.
2. Забуференный изотонический раствор хлорида натрия.
3. 0,01% раствор поли-Ь-лизина (мол.масса 40000-80000) в забуференном
изотоническом растворе хлорида натрия.
4. 0.0004% раствор этидиума бромида
5. Моноклональные антитела ОКТ3+, ОКТ4+, ОКТ8+ или их аналоги, выпус-
каемые Институтом иммунологии Минздрава РФ, Нижегородским НИИВС
Минздрава РФ и другими организациями.
6. Свиные антимышиные антитела, меченные ФИТЦ.
7. Глицерин.
8. Люминесцентный микроскоп.
9. Предметные и покровные стекла.
10. Бытовой холодильник.
11. Лабораторная посуда.
12. Центрифуга с бакет-ротором.

Описание метода

1. Приготовление забуференного изотонического раствора хлорида натрия (ЗФР): 15,6 г №Н2РО растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1 литра (раствор № 1); 35,8 г №2НРО растворить в дистиллированной воде, доведя объем до 1 литра (раствор № 2). Смешать 13 частей раствора № 1 и 37 частей раствора № 2, в полученной смеси растворить 8,5 г №С1; рН раствора должен составить 7,2-7,4.
2. Проведение реакции. Выделенные на градиенте плотности лимфоциты дважды отмывают охлажденным до 4°С ЗФР в течение 10 мин при 1000-1500 об/мин; суспензию лимфоцитов разводят ЗФР до концентрации 2x10 клеток в 1 мл.
Тщательно отмытые и обезжиренные предметные стекла покрывают 0.01% раствором поли-Ь-лизина в ЗФР путем нанесения его на стекло с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37° С (при отсутствии поли-Ь-лизина можно воспользоваться также 0,4% раствором формвара в дихлорэтане, при этом стекло однократно опускают в раствор на 5-10 с; следует помнить, что раствор токсичен и работа с ним требует определенных мер предосторожности - все манипуляции необходимо проводить в вытяжном шкафу). На стекло, покрытое слоем поли-Ь-лизина или формвара, наносят 0,05 мл суспензии лимфоцитов (для определения Т-лимфоцитов и их субпопуляций делают три мазка для подсчета Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+), мазки можно сделать на трех стеклах или на участках одного стекла, в последнем случае мазки следует пометить с помощью воскового карандаша на обратной стороне стекла. Клетки осаждают на стекле во влажной камере при температуре 37°С (в качестве влажной камеры используют чашку Петри с вложенной в нее влажной фильтровальной бумагой). После осаждения клеток препарат осторожно промывают круговыми движениями последовательно в трех сосудах с охлажденным ЗФР. Мазок подсушивают фильтровальной бумагой (не касаясь монослоя клеток). На мазок лимфоцитов наносят один из растворов моноклональных антител, содержащий 3 мкг/мл ОКТ3, ОКТ4 или OKT8 в ЗФР и инкубируют во влажной камере в течение 40 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации препарат осторожно промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл кроличьего антимышиного иммуноглобулина, меченного ФИТЦ, разведенного 1:50 в ЗФР, и инкубируют во влажной камере в течение 30 мин при комнатной температуре. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. На мазок наносят 10-15 мкл 0,0004% (1 мг в 250 мл дистиллированной воды) этидиума бромида; стекло слегка подогревают, проводя несколько раз над пламенем горелки. Препарат промывают в трех сменах охлажденного ЗФР. Удаляют фильтровальной бумагой избыток жидкости и на мазок наносят 50% раствор глицерина в ЗФР; препарат накрывают покровным стеклом и с помощью фильтровальной бумаги удаляют избыток глицерина.С целью сохранения препарата от высыхания края покровного стекла окантовывают расплавленным парафином.

Учет результатов

Препарат анализируют с помощью люминесцентного микроскопа (последовательность фильтров, начиная от ртутной лампы: ЗСС, ЗСС 24, ФС-1, БС-8). В поле зрения микроскопа видны лимфоциты, ядро которых светится кирпично-красным цветом, а антительный комплекс, связавшийся с поверхностными рецепторами клеток, имеет точечное свечение изумрудно-зеленого цвета. Клетки, имеющие диффузное изумрудно-зеленое или чисто зеленое свечение, являются мертвыми и при анализе не учитываются.
В нескольких полях зрения сосчитывают общее число лимфоцитов и среди них количество клеток, имеющих точечное изумрудно-зеленое свечение.
Процент лимфоцитов, имеющих на своей поверхности дифференцировочные антигены CD3+, CD4+,CD 8+ определяют после подсчета 200 клеток.
По результатам подсчета количества CD4+ и CD 8+ лимфоцитов, т. е. Т-хелперов и Т-супрессоров, рассчитывают индекс дифференцировки лимфоцитов
(ИД): CD4+/CD8+.



Похожие статьи Добавь в закладки

Категория: Иммунология | Добавил: MedVUZ | Теги: иследование, иммунолгия, лабораторная диагностика, т-лимфоциты, лимфоциты, антигены
Просмотров: 6499 | Загрузок: 0 | Рейтинг: 3.0/2
Всего комментариев: 0
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи.
[ Регистрация | Вход ]

РязГМУ поступить контакты сайт история медицинская академия информация скачать акушерство ОЗЗ Доктор Хаус Scrubs сериалы хирургия телефон лекции стоматология офтальмология Хью Лори клиника экзамен Теория Лжи юмор интерны актёры Доктор Тырса терапия PDF практические навыки фармакология учебник диагностика классификация лечение ЕГЭ травматология