Медицинский портал. студентам, врачам, медицинские книги

скачать медицинские учебники, лекции

Главная » Файлы » Иммунология

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 (ИЛ-2)
06.05.2010, 17:27


Материалы и оборудование

1. Среда 199 (Московский институт полиомиелита и вирусных препаратов).
2. Среда RPMI 1640 (Московский институт полиомиелита и вирусных пре-
паратов).
3. Эмбриональная телячья сыворотка (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).
4. L-глютамин.
5. HEPES (Серова, ФРГ).
6. Гентамицин.
7. 2-меркаптоэтанол (Серова, ФРГ).
8. Конканавалин А (Алаинский завод химреактивов).
9. Форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА).

10. Метил-а-маннопиранозид (Серова, ФРГ).
11. Н-тимидин.

12. 0.05 М "трис"-Н^-буфер (25 мл 0,2 М раствора триоксиметиламиноме-тана, 45 мл 0,1 н раствора НО^, 30 мл дистиллированной воды).
13. Планшеты для иммунологических реакций Ленинградского завода медицинских полимеров.
14. Пластиковые матрасы для культивирования клеток (Нунклон, Дания). Можно использовать стеклянные матрасы.
15. Фильтры "Владипор" с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм.
16. Микропипетки с регулируемым объемом.
17. СО2-инкубатор.
18. Ламинарный бокс.
19. Харвестер для переноса клеток на фильтры (Дайнатек, Швейцария или
собственного изготовления).
20. Стекловолокнистые фильтры (Ватман, США).
21. Центрифуга с охлаждением.
22. Сцинтилляционный счетчик.
23. Трихлоруксусная кислота, толуол, РРО, РОРОР, этанол.

Описание метода

Приготовление сред. При получении ИЛ-2 используют две основные среды:
Среда №1 (для отмывки клеток) - среда 199, обогащенная 10% (по объему) эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентами-цина.
Среда №2 (для культивирования клеток) - среда RPMI 1640, с 2 мМ L-глютамина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, 6x10 М 2-меркаптоэтанола, 1-5% ЭТС, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.
Для длительного хранения клеток в жидком азоте используют следующие среды:
Среда №3 (для замораживания клеток) - среда RPMI 1640, 20% ЭТС, 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
Среда №4 (для размораживания клеток) - среда 199, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мМ HEPES.

Приготовление клеточных суспензий

В качестве стандартного препарата ИЛ-2 используют супернатант мышиных или крысиных селезеночных клеток, стимулированных КонА. Суспензию клеток селезенки получают в стеклянном гомогенизаторе или любым другим доступным способом, фильтруют через стальную или капроновую сеточку с отверстиями диаметром около 100 мкм, затем 3 раза отмывают в среде N1 8-10 мин при 400 g.
Следует отметить, что ИЛ-2, полученный от крысы или мыши, не действует на лимфоциты человека, в то время как человеческий ИЛ-2 активирует не только Т-клетки человека, но и лимфоциты лабораторных животных. Для получения человеческого ИЛ-2 используют лейкоциты периферической крови, полученные путем градиентного центрифугирования в растворе фикол-пак или любым другим способом. Источником человеческого ИЛ-2 могут служить также некоторые перевиваемые клеточные линии (например: Jurkat-FHCRC).
Для получения мышиного ИЛ-2 в безмитогенной системе служит одна из сублиний лимфомы EI-4. Клетки EI-4 пассируют на мышах С57ВГ/6, вводя им внутрибрюшинно по 10 клеток в 1 мл среды 199. Через 8-10 суток у животных забирают асцитную жидкость и 3 раза промывают клетки, содержащиеся в ней, в среде №1.
Культуру EI-4 можно поддерживать in vitro в пластиковых матрасах. Клеточную суспензию (0,3-0,5 млн в мл) инкубируют в среде №2 с 5% ЭТС при 37°С и 5% СО в течение 48-72 часов. Затем клетки снимают со дна матраса палочкой с наконечником из силиконовой резины, сделанным, например, из пробки от пенициллинового флакона.
Часть клеток EI-4 идет на получение ИЛ-2, а избыток можно хранить в жидком азоте. С этой целью клетки разводят в среде №3 до концентрации 40-50 млн/мл и помещают на 2-4 часа в морозильник с температурой -20°С. Затем клетки переносят в морозильник с температурой -70°С и только после этого - в жидкий азот.
Размораживают клеточную суспензию в водяной бане при 37°С. После размораживания клетки разводят средой №4 так, чтобы конечная концентрация ДМСО в среде не превышала 1%, и промывают 3 раза в среде №4.
В суспензии, приготовленной любым из перечисленных способов, определяют с помощью окраски трипановым синим процент жизнеспособных клеток и приступают к их культивированию для получения ИЛ-2.

Продукция ИЛ-2

Клетки EI-4 в концентрации 1 млн/мл ресуспендируют в среде №2 и культивируют в пластиковых матрасах в присутствии 10 мг/мл РМА. (Концентрация ЭТС в среде не должна превышать 1%). Спленоциты в концентрации 10 млн/мл культивируют в среде №2 с 5% ЭТС в присутствии 2,0 мкг/мл КонА.
После 40-часового культивирования при 37°С в атмосфере с 5% СО из матрасов собирают культуральную жидкость, центрифугируют ее 8-10 мин при 400g и диализуют против 0.05М "трис''-HCL буфера для удаления ингибирую-щих субстанций и низкомолекулярных веществ. Диализ проводят в течение 48 часов на магнитной мешалке при 4-10°С с однократной сменой буфера. После диализа супернатанты обогащают пятикратной средой RPMI 1640 для восстановления изотоничности (1 объем среды к 4 объемам супернатанта) и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Супернатанты хранят при -20°С до использования.
Очистка супернатанта, содержащего ИЛ-2, проводится в несколько этапов. Вначале препарат подвергают высаливанию сульфатом аммония при 80% насыщении на холоду, после чего преципитат диализируют против 0,05М "трис"-HCL буфера. Полученный материал фракционируют на колонках с сефадексом С-100, уравновешенным 0,22-0,24% бикарбонатом натрия. Мышиный ИЛ-2 элюируется во фракции с молекулярной массой 30 кД. После колонки каждую пробу обогащают 10-кратной средой RPMI-1640 (1 объем среды добавляют к 9 объемам фракции) и эмбриональной телячьей сыворотки (до 1%, так как в бессывороточной среде ИЛ-2 плохо сохраняется). Каждую пробу фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и тестируют на биологическую активность. Концентрирование белка после колонки проводят с применением фильтров Amikon UM-2 или UM-10.
Дальнейшую очистку ИЛ-2 можно производить с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефацеле, изоэлектрофокусированием и электрофорезом в SOS-полиакриламидном геле.

Тестирование биологической активности ИЛ-2


Тестирование биологической активности ИЛ-2 и супернатантов, содержащих его, основано на использовании ИЛ-2-зависимых Т-клеточных линий и клонов. Однако такие клоны довольно трудно получить и поддерживать. Другой способ тестирования основан на способности ИЛ-2 поддерживать рост Т-кл., активированных митогеном.
Для получения активированных клеток (КонА-бластов) спленоциты мышей в концентрации 5 млн/мл (в среде №2 с 5% ЭТС) стимулируют 2,0 мкг/мл КонА в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Стимуляцию можно осуществлять в пластиковых матрасах. После окончания культивирования клетки промывают 3 раза средой №1 и разводят в среде №2 с 5% ЭТС до концентрации 8x10 /мл. Следует помнить, что вместе с клетками может остаться небольшое количество КонА, способного вызывать такое же действие, как ИЛ-2. Блокирование активности КонА достигается добавлением в среду 0,1М метил-а-Б-маннопиранозида.
Тестирование активности ИЛ-2 производят в планшетах для иммунологических реакций. Вначале получают несколько серийных двукратных разведений ИЛ-2 в среде №2 (обычно берут по 4 лунки на каждое разведение). Напри-мер,при разведении ИЛ-2 от 1:2 до 1:1024 в 1 и 2 лунки одного ряда планшета вносят по 100 мкл супернатанта, а в 3-10 - по 50 мкл среды №2. Затем из второй лунки забирают 50 мкл, переносят в следующую, 3-ю лунку, перемешивают и т. д. Аналогичные разведения получают еще в 3 рядах планшета.
После разведения ИЛ-2 в каждую лунку добавляют по 50 мкл 0.4М раствора метил-а-Б-маннопиранозида в среде №2, 50 мкл отмытых КонА-бластов, разведенных до концентрации 8x10 /мл. Общий объем в лунке доводят до 0,2 мл средой №2. В качестве контроля вместо супернатанта также вносят среду №2. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С в атмосфере с 5% СО. Пролиферацию в культуре оценивают по включению "Н-тимидина: за 4-5 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи изотопа с молярной активностью 1 Ки/мМ в общем объеме 10 мкл.
После окончания культивирования клетки переносят с помощью харвестера или пипетки на фильтры (стекловолокнистые СГ/с для харвестера или фильтры "Владипор" при использовании установки для вакуумного фильтрования). Осажденные клетки промывают средой 199 (примерно 10 мл на каждую лунку), преципитируют метку 5% трихлоруксусной кислотой (5 мл/лунку), промывают фильтр этанолом (5 мл/лунку) и высушивают. Подсчет радиоактивности осуществляют на У-счетчике, помещая фильтр в сцинтилляционную жидкость следующего состава: 3 г 2,5-дифенилоксазола (РРО), 0,1 г 1,4-ди-/5-фенил-2-оксазо-лил/-бензола /РОРОР/, 1 л толуола.
В отсутствие ИЛ-2 КонА-бласты превращаются в малые лимфоциты и после 24-часового культивирования уровень включения "Н-тимидина составляет 200500 имп/мин на 1 лунку. В присутствии ИЛ-2 наблюдается, зависимое от дозы фактора, увеличение включения метки до 10-25 тыс. имп/мин. Данные по включению "Н-тимидина используют для определения активности ИЛ-2 в условных единицах. За 1 единицу принимается такое количество ИЛ-2, которое индуцирует 50% максимальной пролиферации КонА-бластов, наблюдаемой после добавления стандартного образца (супернатанта мышиных спленоцитов, стимулированных КонА, как описано выше). Например: стандартный образец вызывает максимальную пролиферацию клеток, равную 20000 имп/мин. 50% максимальной пролиферации (т.е. 10000 имп/мин) наблюдается при разведении контрольного, стандартного образца в 16 раз. Тестируемый образец ИЛ-2 вызывает пролиферацию, равную 10000 имп/мин, при разведении в 128 раз. Следовательно, так как 1 единица равна разведению 1/16, то в тестируемом образце содержится 128:16=8 единиц ИЛ-2 в 1 мл.

Оценка результатов

ИЛ-2 является одним из важнейших факторов, обеспечивающих нормальное развитие иммунного ответа, поэтому нарушение его продукции свидетельствует
0 серьезных изменениях в иммунологическом статусе организма. Поскольку синтез ИЛ-2 осуществляется Т-клетками, имеющими хелперный фенотип (Lyt-1+, L3T4+ клетками у мышей и ОКТ4+ клетками у человека), ингибиция его продукции указывает в первую очередь на нарушение в этой субпопуляции лимфоцитов. Однако следует учитывать тот факт, что активация Т-хелперов зависит от вспомогательных клеток (макрофагов, дендритических клеток), обеспечивающих процессинг антигена и продукцию интерлейкина-1. Синтез ИЛ-2 в норме осуществляется только после воздействия на продуцирующие клетки ИЛ-
1 и антигена. Следовательно, нарушение продукции ИЛ-1 также может вызвать падение продукции ИЛ-2. Напротив, индукция рецепторов к ИЛ-2 на поверхности Т-клеток является процессом, зависящим, по-видимому, только от антигена и поэтому в ряде ситуаций является более удобным параметром при оценке активности иммунной системы.
Реально в зависимости от целей исследования тестирование можно проводить двумя способами.
1. Изучение способности неизвестного фактора стимулировать продукцию ИЛ-2 или оценка продукции ИЛ-2 в условиях заболевания.
В первом случае лимфоциты стимулируют исследуемым фактором и проверяют супернатант от стимулированных культур на способность поддерживать пролиферацию КонА-бластов. В качестве контроля используют стандартный препарат ИЛ-2 (см. выше). Важно при этом удалить исследуемый фактор из су-пернатанта или блокировать его активность.
Во втором случае лимфоциты инфицированных или здоровых доноров стимулируют лектином (КонА, ФГА), как было описано выше, и сравнивают активность ИЛ-2 в полученных супернатантах.
2. Определение чувствительности лимфоцитов к ИЛ-2 (наличие рецепторов к ИЛ-2 на лимфоцитах).
Лимфоциты активируют КонА или фактором, действие которого нужно исследовать, затем определяют способность полученных в результате бластов про-лиферировать в присутствии стандартного препарата ИЛ-2.
В совокупности предложенная методика дает возможность оценить воздействие различных агентов на ИЛ-2-продуцирующие или ИЛ-2-чувствительные клетки, а также выявить изменения в этих клеточных популяциях в результате воздействия патологических факторов. Существенные изменения в продукции ИЛ-2 или в индукции рецепторов к ИЛ-2 указывают на активацию (или, наоборот, подавление) главным образом клеточных иммунных реакций.


Трактовка полученных результатов лабораторных исследований иммунной системы


Полученные результаты лабораторного тестирования иммунной системы достаточно сложно трактовать в клинической практике. Это связано с рядом факторов. Во-первых, как было ранее отмечено, иммунная система является в значительной степени подвижной для адекватного реагирования на постоянно меняющиеся "атаки" внешнего мира. Поэтому многие иммунологические показатели в норме имеют значительный разброс. Во-вторых, в обязательном порядке необходимо учитывать, что природно-климатические факторы оказывают прямое или опосредованное влияние на функциональные системы организма, в том числе и на иммунную систему, которая при длительном воздействии перестраивается на новый уровень функционирования, адекватный конкретным сре-довым условиям (Лозовой В.П., 1988). Поэтому необходимо в клинической работе опираться на "свои" региональные значения нормативных показателей иммунной системы. Более того, идеально под рукой иметь нормы для самых различных групп населения, разбитых по возрасту и полу.
При нахождении полученного результата в границах доверительного интервала M+m (где M - средняя арифметическая генеральной совокупности, а m -средняя квадратическая ошибка выборочных показателей) он считается не выходящим за границы нормы. В случае если отклонение выражается в снижении уровня показателя на величину от 1G до 2G от М (где G - среднее квадратиче-ское отклонение), то данный результат трактуется как подавление или глубокое подавление показателя.
Необходимо подчеркнуть, заключение обязательно должно учитывать данные анкетного опроса и клинические проявление иммунодефицитного состояния.
Изложенный подход к оценке иммунного статуса хорошо зарекомендовал себя в повседневной клинической и научной практике и далеко не исчерпал своих возможностей и будет широко использоваться в видимой перспективе.
Необходимо отметить, что в настоящее время начата активная разработка нового, патогенетического принципа оценки иммунной системы человека (Ко-вальчук Л.В.,Чередеев А.Н., 1990, 1995), основанного на оценке основных этапов функционирования компонентов иммунной системы, а именно, способности к активации, пролиферации, дифференциации и регуляции. Авторами предлагается иной перечень тестов оценки иммунного статуса включающий как приведенные нами методы, так и ряд совершенно новых методик. Это:
1. Распознавание - оценка Т-клеточного рецептора (ТКР), предоставления антигена, адгезивных молекул (интегрины и др.),смешанная культура лимфоцитов, генный анализ аллотипов HLA, ТКР.
2. Активация - фенотипирование маркеров активации (CD25, CD71, HLA-DRb и др.) при стимуляции фитогемагглютинином, атнтителами к ТКР, CD2 и т.д., выявление вторичных месенжеров (цАМФ, цАТФ, протеинкиназы и др.), отвечаемость на цитокины.
3. Пролиферация - бласттрансформация на митогены, специфические антигены, ответы на факторы роста клеток.
4. Дифференциация (эффекторная функция) - продукция иммуноглобулинов, цитотоксическая функция Т-клеток (CD8+), нормальных киллеров, продукция цитокинов.
5. Регуляция - оценка хелперных и супрессорных функций лимфоидных клеток, анализ функциональных свойств Т-хелперов 1-го и 2-го типов и продуцируемых ими цитокинов, регуляторных свойств моноцитов.
Данный набор методов позволит подойти к более точному пониманию роли отдельных клеточных элементов иммунной системы человека при иммунопатологии. Однако из-за высокой стоимости и сложности выполнения этот комплекс пока не вышел за пределы стен специализированных институтов и соответственно не апробирован в широкой клинической практике. Только накопление фактических данных позволит подтвердить эффектвность этого подхода.



Похожие статьи Добавь в закладки

Категория: Иммунология | Добавил: MedVUZ | Теги: иммунология, интерлейкин-2, лабораторная диагностика, ИЛ-2
Просмотров: 6098 | Загрузок: 0 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи.
[ Регистрация | Вход ]

РязГМУ поступить контакты сайт история медицинская академия информация скачать акушерство ОЗЗ Доктор Хаус Scrubs сериалы хирургия телефон лекции стоматология офтальмология Хью Лори клиника экзамен Теория Лжи юмор интерны актёры Доктор Тырса терапия PDF практические навыки фармакология учебник диагностика классификация лечение ЕГЭ травматология