1. Среда 199 (Московский институт полиомиелита и вирусных препаратов).
2. Среда RPMI 1640 (Московский институт полиомиелита и вирусных пре-
паратов).
3. Эмбриональная телячья сыворотка (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).
4. L-глютамин.
5. HEPES (Серова, ФРГ).
6. Гентамицин.
7. 2-меркаптоэтанол (Серова, ФРГ).
8. Конканавалин А (Алаинский завод химреактивов).
9. Форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА).

10. Метил-а-маннопиранозид (Серова, ФРГ).
11. Н-тимидин.

12. 0.05 М "трис"-Н^-буфер (25 мл 0,2 М раствора триоксиметиламиноме-тана, 45 мл 0,1 н раствора НО^, 30 мл дистиллированной воды).
13. Планшеты для иммунологических реакций Ленинградского завода медицинских полимеров.
14. Пластиковые матрасы для культивирования клеток (Нунклон, Дания). Можно использовать стеклянные матрасы.
15. Фильтры "Владипор" с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм.
16. Микропипетки с регулируемым объемом.
17. СО2-инкубатор.
18. Ламинарный бокс.
19. Харвестер для переноса клеток на фильтры (Дайнатек, Швейцария или
собственного изготовления).
20. Стекловолокнистые фильтры (Ватман, США).
21. Центрифуга с охлаждением.
22. Сцинтилляционный счетчик.
23. Трихлоруксусная кислота, толуол, РРО, РОРОР, этанол.

Приготовление сред. При получении ИЛ-2 используют две основные среды:
Среда №1 (для отмывки клеток) - среда 199, обогащенная 10% (по объему) эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентами-цина.
Среда №2 (для культивирования клеток) - среда RPMI 1640, с 2 мМ L-глютамина, 25 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина, 6x10 М 2-меркаптоэтанола, 1-5% ЭТС, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.
Для длительного хранения клеток в жидком азоте используют следующие среды:
Среда №3 (для замораживания клеток) - среда RPMI 1640, 20% ЭТС, 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
Среда №4 (для размораживания клеток) - среда 199, 50 мкг/мл гентамицина, 10 мМ HEPES.

В качестве стандартного препарата ИЛ-2 используют супернатант мышиных или крысиных селезеночных клеток, стимулированных КонА. Суспензию клеток селезенки получают в стеклянном гомогенизаторе или любым другим доступным способом, фильтруют через стальную или капроновую сеточку с отверстиями диаметром около 100 мкм, затем 3 раза отмывают в среде N1 8-10 мин при 400 g.
Следует отметить, что ИЛ-2, полученный от крысы или мыши, не действует на лимфоциты человека, в то время как человеческий ИЛ-2 активирует не только Т-клетки человека, но и лимфоциты лабораторных животных. Для получения человеческого ИЛ-2 используют лейкоциты периферической крови, полученные путем градиентного центрифугирования в растворе фикол-пак или любым другим способом. Источником человеческого ИЛ-2 могут служить также некоторые перевиваемые клеточные линии (например: Jurkat-FHCRC).
Для получения мышиного ИЛ-2 в безмитогенной системе служит одна из сублиний лимфомы EI-4. Клетки EI-4 пассируют на мышах С57ВГ/6, вводя им внутрибрюшинно по 10 клеток в 1 мл среды 199. Через 8-10 суток у животных забирают асцитную жидкость и 3 раза промывают клетки, содержащиеся в ней, в среде №1.
Культуру EI-4 можно поддерживать in vitro в пластиковых матрасах. Клеточную суспензию (0,3-0,5 млн в мл) инкубируют в среде №2 с 5% ЭТС при 37°С и 5% СО в течение 48-72 часов. Затем клетки снимают со дна матраса палочкой с наконечником из силиконовой резины, сделанным, например, из пробки от пенициллинового флакона.
Часть клеток EI-4 идет на получение ИЛ-2, а избыток можно хранить в жидком азоте. С этой целью клетки разводят в среде №3 до концентрации 40-50 млн/мл и помещают на 2-4 часа в морозильник с температурой -20°С. Затем клетки переносят в морозильник с температурой -70°С и только после этого - в жидкий азот.
Размораживают клеточную суспензию в водяной бане при 37°С. После размораживания клетки разводят средой №4 так, чтобы конечная концентрация ДМСО в среде не превышала 1%, и промывают 3 раза в среде №4.
В суспензии, приготовленной любым из перечисленных способов, определяют с помощью окраски трипановым синим процент жизнеспособных клеток и приступают к их культивированию для получения ИЛ-2.

Клетки EI-4 в концентрации 1 млн/мл ресуспендируют в среде №2 и культивируют в пластиковых матрасах в присутствии 10 мг/мл РМА. (Концентрация ЭТС в среде не должна превышать 1%). Спленоциты в концентрации 10 млн/мл культивируют в среде №2 с 5% ЭТС в присутствии 2,0 мкг/мл КонА.
После 40-часового культивирования при 37°С в атмосфере с 5% СО из матрасов собирают культуральную жидкость, центрифугируют ее 8-10 мин при 400g и диализуют против 0.05М "трис''-HCL буфера для удаления ингибирую-щих субстанций и низкомолекулярных веществ. Диализ проводят в течение 48 часов на магнитной мешалке при 4-10°С с однократной сменой буфера. После диализа супернатанты обогащают пятикратной средой RPMI 1640 для восстановления изотоничности (1 объем среды к 4 объемам супернатанта) и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Супернатанты хранят при -20°С до использования.
Очистка супернатанта, содержащего ИЛ-2, проводится в несколько этапов. Вначале препарат подвергают высаливанию сульфатом аммония при 80% насыщении на холоду, после чего преципитат диализируют против 0,05М "трис"-HCL буфера. Полученный материал фракционируют на колонках с сефадексом С-100, уравновешенным 0,22-0,24% бикарбонатом натрия. Мышиный ИЛ-2 элюируется во фракции с молекулярной массой 30 кД. После колонки каждую пробу обогащают 10-кратной средой RPMI-1640 (1 объем среды добавляют к 9 объемам фракции) и эмбриональной телячьей сыворотки (до 1%, так как в бессывороточной среде ИЛ-2 плохо сохраняется). Каждую пробу фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и тестируют на биологическую активность. Концентрирование белка после колонки проводят с применением фильтров Amikon UM-2 или UM-10.
Дальнейшую очистку ИЛ-2 можно производить с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефацеле, изоэлектрофокусированием и электрофорезом в SOS-полиакриламидном геле.

Тестирование биологической активности ИЛ-2 и супернатантов, содержащих его, основано на использовании ИЛ-2-зависимых Т-клеточных линий и клонов. Однако такие клоны довольно трудно получить и поддерживать. Другой способ тестирования основан на способности ИЛ-2 поддерживать рост Т-кл., активированных митогеном.
Для получения активированных клеток (КонА-бластов) спленоциты мышей в концентрации 5 млн/мл (в среде №2 с 5% ЭТС) стимулируют 2,0 мкг/мл КонА в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Стимуляцию можно осуществлять в пластиковых матрасах. После окончания культивирования клетки промывают 3 раза средой №1 и разводят в среде №2 с 5% ЭТС до концентрации 8x10 /мл. Следует помнить, что вместе с клетками может остаться небольшое количество КонА, способного вызывать такое же действие, как ИЛ-2. Блокирование активности КонА достигается добавлением в среду 0,1М метил-а-Б-маннопиранозида.
Тестирование активности ИЛ-2 производят в планшетах для иммунологических реакций. Вначале получают несколько серийных двукратных разведений ИЛ-2 в среде №2 (обычно берут по 4 лунки на каждое разведение). Напри-мер,при разведении ИЛ-2 от 1:2 до 1:1024 в 1 и 2 лунки одного ряда планшета вносят по 100 мкл супернатанта, а в 3-10 - по 50 мкл среды №2. Затем из второй лунки забирают 50 мкл, переносят в следующую, 3-ю лунку, перемешивают и т. д. Аналогичные разведения получают еще в 3 рядах планшета.
После разведения ИЛ-2 в каждую лунку добавляют по 50 мкл 0.4М раствора метил-а-Б-маннопиранозида в среде №2, 50 мкл отмытых КонА-бластов, разведенных до концентрации 8x10 /мл. Общий объем в лунке доводят до 0,2 мл средой №2. В качестве контроля вместо супернатанта также вносят среду №2. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С в атмосфере с 5% СО. Пролиферацию в культуре оценивают по включению "Н-тимидина: за 4-5 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносят по 2 мкКи изотопа с молярной активностью 1 Ки/мМ в общем объеме 10 мкл.
После окончания культивирования клетки переносят с помощью харвестера или пипетки на фильтры (стекловолокнистые СГ/с для харвестера или фильтры "Владипор" при использовании установки для вакуумного фильтрования). Осажденные клетки промывают средой 199 (примерно 10 мл на каждую лунку), преципитируют метку 5% трихлоруксусной кислотой (5 мл/лунку), промывают фильтр этанолом (5 мл/лунку) и высушивают. Подсчет радиоактивности осуществляют на У-счетчике, помещая фильтр в сцинтилляционную жидкость следующего состава: 3 г 2,5-дифенилоксазола (РРО), 0,1 г 1,4-ди-/5-фенил-2-оксазо-лил/-бензола /РОРОР/, 1 л толуола.
В отсутствие ИЛ-2 КонА-бласты превращаются в малые лимфоциты и после 24-часового культивирования уровень включения "Н-тимидина составляет 200500 имп/мин на 1 лунку. В присутствии ИЛ-2 наблюдается, зависимое от дозы фактора, увеличение включения метки до 10-25 тыс. имп/мин. Данные по включению "Н-тимидина используют для определения активности ИЛ-2 в условных единицах. За 1 единицу принимается такое количество ИЛ-2, которое индуцирует 50% максимальной пролиферации КонА-бластов, наблюдаемой после добавления стандартного образца (супернатанта мышиных спленоцитов, стимулированных КонА, как описано выше). Например: стандартный образец вызывает максимальную пролиферацию клеток, равную 20000 имп/мин. 50% максимальной пролиферации (т.е. 10000 имп/мин) наблюдается при разведении контрольного, стандартного образца в 16 раз. Тестируемый образец ИЛ-2 вызывает пролиферацию, равную 10000 имп/мин, при разведении в 128 раз. Следовательно, так как 1 единица равна разведению 1/16, то в тестируемом образце содержится 128:16=8 единиц ИЛ-2 в 1 мл.

ИЛ-2 является одним из важнейших факторов, обеспечивающих нормальное развитие иммунного ответа, поэтому нарушение его продукции свидетельствует
0 серьезных изменениях в иммунологическом статусе организма. Поскольку синтез ИЛ-2 осуществляется Т-клетками, имеющими хелперный фенотип (Lyt-1+, L3T4+ клетками у мышей и ОКТ4+ клетками у человека), ингибиция его продукции указывает в первую очередь на нарушение в этой субпопуляции лимфоцитов. Однако следует учитывать тот факт, что активация Т-хелперов зависит от вспомогательных клеток (макрофагов, дендритических клеток), обеспечивающих процессинг антигена и продукцию интерлейкина-1. Синтез ИЛ-2 в норме осуществляется только после воздействия на продуцирующие клетки ИЛ-
1 и антигена. Следовательно, нарушение продукции ИЛ-1 также может вызвать падение продукции ИЛ-2. Напротив, индукция рецепторов к ИЛ-2 на поверхности Т-клеток является процессом, зависящим, по-видимому, только от антигена и поэтому в ряде ситуаций является более удобным параметром при оценке активности иммунной системы.
Реально в зависимости от целей исследования тестирование можно проводить двумя способами.
1. Изучение способности неизвестного фактора стимулировать продукцию ИЛ-2 или оценка продукции ИЛ-2 в условиях заболевания.
В первом случае лимфоциты стимулируют исследуемым фактором и проверяют супернатант от стимулированных культур на способность поддерживать пролиферацию КонА-бластов. В качестве контроля используют стандартный препарат ИЛ-2 (см. выше). Важно при этом удалить исследуемый фактор из су-пернатанта или блокировать его активность.
Во втором случае лимфоциты инфицированных или здоровых доноров стимулируют лектином (КонА, ФГА), как было описано выше, и сравнивают активность ИЛ-2 в полученных супернатантах.
2. Определение чувствительности лимфоцитов к ИЛ-2 (наличие рецепторов к ИЛ-2 на лимфоцитах).
Лимфоциты активируют КонА или фактором, действие которого нужно исследовать, затем определяют способность полученных в результате бластов про-лиферировать в присутствии стандартного препарата ИЛ-2.
В совокупности предложенная методика дает возможность оценить воздействие различных агентов на ИЛ-2-продуцирующие или ИЛ-2-чувствительные клетки, а также выявить изменения в этих клеточных популяциях в результате воздействия патологических факторов. Существенные изменения в продукции ИЛ-2 или в индукции рецепторов к ИЛ-2 указывают на активацию (или, наоборот, подавление) главным образом клеточных иммунных реакций.

Полученные результаты лабораторного тестирования иммунной системы достаточно сложно трактовать в клинической практике. Это связано с рядом факторов. Во-первых, как было ранее отмечено, иммунная система является в значительной степени подвижной для адекватного реагирования на постоянно меняющиеся "атаки" внешнего мира. Поэтому многие иммунологические показатели в норме имеют значительный разброс. Во-вторых, в обязательном порядке необходимо учитывать, что природно-климатические факторы оказывают прямое или опосредованное влияние на функциональные системы организма, в том числе и на иммунную систему, которая при длительном воздействии перестраивается на новый уровень функционирования, адекватный конкретным сре-довым условиям (Лозовой В.П., 1988). Поэтому необходимо в клинической работе опираться на "свои" региональные значения нормативных показателей иммунной системы. Более того, идеально под рукой иметь нормы для самых различных групп населения, разбитых по возрасту и полу.
При нахождении полученного результата в границах доверительного интервала M+m (где M - средняя арифметическая генеральной совокупности, а m -средняя квадратическая ошибка выборочных показателей) он считается не выходящим за границы нормы. В случае если отклонение выражается в снижении уровня показателя на величину от 1G до 2G от М (где G - среднее квадратиче-ское отклонение), то данный результат трактуется как подавление или глубокое подавление показателя.
Необходимо подчеркнуть, заключение обязательно должно учитывать данные анкетного опроса и клинические проявление иммунодефицитного состояния.
Изложенный подход к оценке иммунного статуса хорошо зарекомендовал себя в повседневной клинической и научной практике и далеко не исчерпал своих возможностей и будет широко использоваться в видимой перспективе.
Необходимо отметить, что в настоящее время начата активная разработка нового, патогенетического принципа оценки иммунной системы человека (Ко-вальчук Л.В.,Чередеев А.Н., 1990, 1995), основанного на оценке основных этапов функционирования компонентов иммунной системы, а именно, способности к активации, пролиферации, дифференциации и регуляции. Авторами предлагается иной перечень тестов оценки иммунного статуса включающий как приведенные нами методы, так и ряд совершенно новых методик. Это:
1. Распознавание - оценка Т-клеточного рецептора (ТКР), предоставления антигена, адгезивных молекул (интегрины и др.),смешанная культура лимфоцитов, генный анализ аллотипов HLA, ТКР.
2. Активация - фенотипирование маркеров активации (CD25, CD71, HLA-DRb и др.) при стимуляции фитогемагглютинином, атнтителами к ТКР, CD2 и т.д., выявление вторичных месенжеров (цАМФ, цАТФ, протеинкиназы и др.), отвечаемость на цитокины.
3. Пролиферация - бласттрансформация на митогены, специфические антигены, ответы на факторы роста клеток.
4. Дифференциация (эффекторная функция) - продукция иммуноглобулинов, цитотоксическая функция Т-клеток (CD8+), нормальных киллеров, продукция цитокинов.
5. Регуляция - оценка хелперных и супрессорных функций лимфоидных клеток, анализ функциональных свойств Т-хелперов 1-го и 2-го типов и продуцируемых ими цитокинов, регуляторных свойств моноцитов.
Данный набор методов позволит подойти к более точному пониманию роли отдельных клеточных элементов иммунной системы человека при иммунопатологии. Однако из-за высокой стоимости и сложности выполнения этот комплекс пока не вышел за пределы стен специализированных институтов и соответственно не апробирован в широкой клинической практике. Только накопление фактических данных позволит подтвердить эффектвность этого подхода.