Медицинский портал. студентам, врачам, медицинские книги

скачать медицинские учебники, лекции

Главная » Файлы » Иммунология

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА
27.04.2010, 11:24


Материалы и оборудование

1. Лабораторное оборудование:

1) стерильное рабочее место;
2) холодильник на +4° С;
3) морозильник на -20° С;
4) набор автоматических 1и 8-канальных микропипеток на различные рабочие объемы;
5) лабораторная центрифуга;
6) ридер для иммуноферментного анализа;
7) инвертированный микроскоп.

2. Растворы и питательные среды:

1) среда Игла (может заменяться на среду ДМЕМ, 199 или аналогичные);
2) среда 4 RPMI-1640;
3) сыворотка крови крупного рогатого скота или сыворотка крови плодов коровы;
4) 0,1 н. раствор 0 HCL;
5) 0,1 н. раствор 0 NaOH;
6) Раствор энтеротоксина 0 St.aureus (СЭА).

3. Культура клеток:

L-41 (культура клеток карциномы легкого человека)

4. Вирусы:

1) вирус болезни Ньюкасла (NDV);
2) вирус везикулярного стоматита (BBC), штамм Индиана.

5. Расходные материалы:

1) микропланшеты для культуральных работ;
2) наконечники для микропипеток, эппендорфы;
3) стерильные салфетки.
6. Другие реактивы:
1) антибиотики (пенициллин, стрептомицин);
2) референс-препараты человеческого ИФН.

7. Прочее:

1) лабораторная посуда, дезинфектанты, стерилизаторы и др.

Описание метода

Основные принципы предлагаемой методики заключаются в том, что ИФН обладает антивирусной активностью, проявляющейся в торможении репродукции вируса и, следовательно, в ингибировании его цитопатического действия (ЦПД), проявляющегося в деструкции монослоя клеток после их инкубации с вирусом. Торможение развития ЦПД можно охарактеризовать количественно, окрашивая клеточный монослой после инкубации с ИФН-содержащими пробами, и индикаторным вирусом. Количество абсорбированного клетками красителя обратно пропорциональны степени развития ЦПД и прямо пропорциональны содержания ИФН в исследуемых пробах.
Основные стадии анализа: 1) получение монослойной клеточной культуры; 2) преинкубация клеточного монослоя с ИФН-содержащими пробами; 3) инкубация клеточного монослоя с раствором индикаторного вируса; 4) учет результатов анализа (окраска лунок с клетками и определение степени деструкции монослоя).

Забор крови и подготовка анализируемых проб

В стерильные пробирки, в которые предварительно внесено необходимое количество стерильного антикоагулянта (гепарин, трилон В и др. нетоксичные антикоагулянты) в виде концентрированного (для исключения разбавления исходного образца) раствора на среде RPMI-1640 или на физиологическом растворе, так, чтобы конечная концентрация антикоагулянта, например для гепарина, составила 15-20 ед., отбирается венозная кровь объемом от 0,5 до 2 мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при +4° С без потери всех необходимых свойств.

Подготовка анализируемых проб

В соответствии с литературными данными, универсальными показателями, наиболее полно отражающими состояние системы интерферона, являются:
1) содержание общего сывороточного интерферона ^ИФН);
2) количественное определение способности лейкоцитов крови продуцировать а-интерферон (ИФН-а) и у-интерферон (ИФН-у) в ответ на специфическое индуцирующее воздействие (индукция ИФН-а, ИФН-у). Для анализа вышеперечисленных параметров цельную кровь необходимо обработать следующим образом:
а) в стерильные эппендорфы вносится Среда RPMI-1640 с добавлением глу-тамина, антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл), 2% сыворотки крупного рогатого скота (КРС); растворы индукторов интерферона (вирус NDV для ИФН-а и СЭА для ИФН-у) и цельная кровь в соотношении 8/1/1 (например, 200 мкл RPMI-1640, 25 мкл раствора индуктора,
25 мкл цельной крови). Полученная индукционная смесь инкубируется при 37°С в течение 24 часов, затем в эппендорфы, в которых производится индукция ИФН-а, добавляется 0,1 н. раствор HCL до рН 2,0, и проба инкубируется в течение 1 часа при 37°С, после чего в нее вносится 0,1 н. раствор №ОН до рН 7,4. Обработанные таким образом пробы с индуцированным ИФН-а и ИФН-у замораживаются и хранятся при -25°С. б) цельная кровь центрифугируется при 1000 g, после чего в стерильный эп-пендорф отбирается 50-200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного интерферона ^ИФН). Отобранная сыворотка замораживается и хранится при -25°С.

Постановка анализа

Получение монослоя клеток. В стерильные микропланшеты для культур клеток, предварительно обработанные УФО в течение 1,5-2 часов, вносится суспензия клеток L-41 в ростовой питательной среде (РС) концентрацией 500000 клеток/мл из расчета 100 мкл суспензии в лунку. Ростовая среда представляет собой среду Игла, содержащую 10% сыворотки КРС, глутамин (300 мг/л), антибиотики (пенициллин, стрептомицин по 100 ед/мл). Засеянные микропланшеты помещаются в CO-термостат при 37°С до образования полного монослоя клеток (при соблюдении указанных условий монослой образуется через 24 часа).

Подготовка проб индуцированных ИФН-а и ИФН-у к анализу

После образования полного монослоя в микропланшеты вносятся интерфе-ронсодержащие пробы. Непосредственно перед анализом пробы, содержащие индуцированный ИФН-у центрифугируют при 1500 g в течение 10-15 мин для осаждения клеточных элементов; пробы, содержащие индуцированный ИФН-а центрифугируют при 3000-4000 g в течение 20-30 мин для осаждения выпавших в осадок белков и клеточных элементов.

Титрование ИФН-содержащих проб

Титрование интерферонсодержащих проб производится во вспомогательных 96-луночных микропланшетах (можно использовать планшеты для иммунологических реакций, иммуноферментного анализа и др., объем лунок которых не менее 300 мкл), предварительно обработанных УФО в течение 1,5-2 часов.
Титрование ИФН-содержащих проб осуществляется следующим образом: в лунки вспомогательного микропланшета 8-канальной микропипеткой вносится по 150 мкл поддерживающей питательной среды (ПС), являющейся полным аналогом РС, но содержащей только 2% сыворотки КРС, вместо 10%. После этого в лунки ряда "А" последовательно вносятся анализируемые пробы в количестве 150 мкл и раститровываются по лункам рядов "В"-"Н" соответствующих столбцов перенесением в каждую последующую лунку 150 мкл пробы, так, что коэффициент разведения от лунки к лунке равен 2.
При этом далеко не всегда целесообразно начинать титрование проб с разведения "2" (вносить в лунки ряда "А" по 150 мкл анализируемой пробы), так как обычно анализируемые пробы обычно содержат не менее 8-10 МЕ/мл ИФН. Поэтому в целях уменьшения количества материала, отбираемого для анализа (венозной или капилярной крови), возможно внесение в лунки ряда "А" 30 или 60 мкл пробы (с предварительным внесением в лунки ряда "А" 270 или 240 мкл ПС соотв.), так, чтобы общий объем смеси в лунках ряда "А" равнялся 300 мкл, как и в случае титрования начиная с разведения 1:2, но при выполнении данных условий внесения проб первоначальное разведение составит 1:5 (или 1:10 соотв.). Раститровка проб осуществляется также перенесением 150 мкл в каждую последующую лунку с падением концентрации ИФН в 2 раза (от лунок ряда "А" к лункам ряда "Д" концентрация изменяется соответственно как: 1:5; 1:10; 1:20; 1:40 или 1:10; 1:20; 1:40; 1:80).Такая схема титрования позволяет снизить количество лунок на один анализ (4 лунки на одну параллельную аналитическую точку) при использовании при учете результатов анализа с применением методики получения кривой количественной зависимости поглощения специфического красителя клетками от содержания ИФН в инкубационной среде (см. ниже).
Таким образом, в каждой лунке вспомогательного микропланшета содержится по 150 мкл пробы необходимого разведения.
Для удобства и унифицирования анализа пробы рекомендуется располагать в микропланшетах следующим образом:
1) столбцы 1 и 2 рядов "А" - "G": референс препарат ИФН с рядом вертикального падения концентрации: 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,76 МЕ/мл;
2) столбцы 1 и 2 ряда "Н": не содержащие ИФН контрольные пробы (ПС) для контроля протекания процесса развития цитопатического действия (ЦПД) индикаторного вируса;
3) столбцы 3 - 12 рядов "А" - "Н": раститрованные в 4-х или 8-ми лунках анализируемые пробы.
После проведения титрования исследуемых ИФН-содержащих проб во вспомогательном микропланшете анализируемый материал переносится в микропланшеты с выращенным монослоем клеток (опытные микропланшеты). Для этого непосредственно перед перенесением из опытных микропланшетов с клетками вытряхивается ростовая среда (или же отсасывается специальным вакуумным устройством), остатки РС вытряхиваются на стерильную бумажную или тканевую салфетку, и в лунки опытных микропланшетов 8-канальной микропипеткой переносится по 100 мкл опытных образцов в строгом соответствии с расположением их во вспомогательных микропланшетах.
Затем опытные микропланшеты, содержащие клеточный монослой с нанесенными анализируемыми пробами помещаются в СО-термостат при 37°С на 24 часа.

Инкубация клеток с индикаторным вирусом

После 24 часов инкубации из микропланшетов вытряхивают ПС с раститро-ванными пробами и в каждую лунку вносится по 100 мкл ПС, содержащей 100 цитопатических доз (ЦПД) индикаторного вируса - вируса везикулярного стоматита (ВВС) штамм Индиана. Необходимый для проведения анализа ВВС накапливается заражением монослойной культуры L-41, отбором и лиофилизацией культуральной жидкости после достижения 70-80% полной деструкции монослоя клеток; инфекционность вируса определяется предварительным титрованием вирусосодержащей жидкости в условиях, аналогичных проведению анализа определения ИФН статуса.
После внесения ВВС в опытные микропланшеты последние помещаются в СО-термостат при 37°С на 18-24 часа.
Остановка инкубации производится при достижении 100% деструкции монослоя клеток в лунках с контролем ВВС и при значительной деструкции монослоя в лунках, содержавших наибольшие разведения референса ИФН и исследуемых проб. Оптимальным считается момент остановки инкубации в то время, когда достигнута 90-100%-ная деструкция монослоя в лунках, содержавших 0,78 МЕ/мл референса ИФН и соотв. 20-30%-ная деструкция монослоя в лунках, содержавших 1,56 МЕ/мл референса ИФН. При соблюдении этих условий достигается максимальная чувствительность методики, позволяющая определять содержание ИФН в пробах с точностью до +1 МЕ/мл.

Учет результатов анализа

После остановки инкубации клеточного монослоя с ВВС из планшетов вытряхивается вирусосодержащая жидкость и в каждую лунку 8-канальной микропипеткой вносится 50 мкл раствора красителя кристаллического фиолетового (0,5% раствор на 30% этаноле). Окрашивание производится в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого из микропланшетов вытряхивается раствор красителя и микропланшеты промываются в проточной водопроводной воде комнатной температуры погружением 5-10 раз. Затем микропланшеты высушиваются на воздухе.
Учет результатов можно производить визуально, определяя степень деструкции монослоя клеток в каждой лунке по степени окрашивания дна лунок. При этом в качестве калибровочной кривой используются столбцы микропланшета, в которых был раститрован референс-препарат ИФН. Сравнивая плотность клеточного монослоя в лунках с референсом ИФН и в опытных лунках находится какая-либо лунка в столбцах с референсом ИФН, которая соответствовала бы по плотности монослоя рассматриваемой опытной лунке. Таким образом, зная концентрации референса ИФН в каждой из лунок и разведение опытной пробы, определяется истинная концентрация ИФН в анализируемой пробе.
Более точный учет результатов производится с помощью точного определения абсорбированного клетками монослоя красителя. Это достигается путем добавления в каждую лунку микропланшета 100 мкл 30% этанола и 1-часовой экстракцией красителя при 37°С. После этого из каждой лунки 75 мкл экстракта переносится 8-канальной микропипеткой в микропланшет для иммунофермент-ного анализа (ИФА) и последующим сканированием микропланшета на ридере для ИФА. Измерения проводятся при длине волны, как можно более близкой к 590 нм (максимум поглощения раствора кристаллического фиолетового в 30% этаноле). После получения значений величин оптической плотности экстракта строится калибровочная кривая зависимости степени деструкции клеточного монослоя от концентрации интерферона, используя данные по референсу ИФН. Затем по полученной калибровочной кривой определяется содержание ИФН в анализируемых пробах, выраженное в международных единицах (МЕ) на мл. При этом необходимо учитывать все коэффициенты разведения для каждого исследуемого образца.
Для исключения возможных аберраций, присущих каждой биологической системе, иногда приводящих к появлению несистематических ошибок, рекомендуется на каждом микропланшете проставлять дополнительные контрольные точки (например, анализ 8ИФН и индукции ИФН-а, ИФН-у доноров), дублирующиеся на каждом очередном микропланшете. Для этого необходимо отобрать несколько мл сыворотки крови и провести индукцию ИФН-а, ИФН-у в большом объеме.



Похожие статьи Добавь в закладки

Категория: Иммунология | Добавил: MedVUZ | Теги: интерферон, иммунология, лабораторная диагностика
Просмотров: 6958 | Загрузок: 0 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи.
[ Регистрация | Вход ]

РязГМУ поступить контакты сайт история медицинская академия информация скачать акушерство ОЗЗ Доктор Хаус Scrubs сериалы хирургия телефон лекции стоматология офтальмология Хью Лори клиника экзамен Теория Лжи юмор интерны актёры Доктор Тырса терапия PDF практические навыки фармакология учебник диагностика классификация лечение ЕГЭ травматология